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é nato prima l’uovo o la gallina?

fotosintesi e respirazione… chi è comparso per primo?

E’ largamente accettato che l’atmosfera terrestre quando è comparsa la vita sulla terra avesse concentrazioni di ossigeno molto basse, largamente inferiori all’1% dell’attuale concentrazione (Holland, 1994). Queste concentrazioni non sarebbero di certo sufficienti a far avvenire la respirazione cellulare. Questo argomento infatti ha supportato per lungo tempo l’ipotesi che la fotosintesi fosse comparsa per prima e che fossero stati necessari diverse migliaia di anni prima che si accumulasse ossigeno a sufficienza e comparisse il metabolismo ossidativo.

Tuttavia una reinterpetazione dei dati geologici, incluso lo studio di fossili trovati al di sotto di profondi strati di sedimenti  e lo studio dello stato di ossidazione del ferro trovato all’interno di rocce dell’Archeano, ha riaperto la questione riguardo alla concentrazione di ossigeno nell’atmosfera primordiale, portando alla proposta che concentrazioni pari all’1-2% della concentrazione attuale di ossigeno fossero comuni (Towe ,1990, 1994, 1996; Ohmoto 1996, 1997). E’ inoltre verosimile che la presenza di venti idrotermali sottomarini rendesse disponibili molecole inorganiche ridotte quali H2S, H2, CO e NH4. Tutto questo avrebbe potuto sostenere varie forme di respirazione aerobica ed anaerobica.

In ogni caso, qualsiasi forma di respirazione richiede, come abbiamo visto insieme in classe, la presenza di una membrana ben formata e quella di una valvola in grado di sfruttare l’energia (proprio come l’ATP sintasi). E’ pertanto più che verosimile che all’inizio esistessero delle forme di fermentazione e che solo in un secondo momento siano comparsi fotosintesi e respirazione. Chi per primo?

Il ritrovamento di fossili datati 3500 milioni di anni fa che sembravano attestare la presenza di antichi cianobatteri, ha supportato l’ipotesi che delle forme primitive di fotosintesi fossero comparse per prime (Cavalier-Smith, 2001). Tuttavia questi fossili sono stati più recentemente interpretati come artefatti generatisi da grafite amorfa, riportando così la questione “fotosintesi o respirazione” al punto di partenza (Brasier et al., 2002).

Studi di filogenesi molecolare dei complessi responsabili per la fotosintesi e la respirazione sembrerebbero supportare l’ipotesi che la respirazione sia più antica (Castresana, 2001). In particolare la fotosintesi non ossigenica, che necessita di un solo fotosistema, sembra essere comparsa più volte nella storia evolutiva e sembra anche che in molti casi sia stata persa, mentre la comparsa della fotosintesi ossigenica che usa due fotosistemi in sequenza sembra essere comparsa molto tardi e dopo la respirazione.

riassumendo:

  • per primi sarebbero arrivati glicolisi e fermentazione
  • rimane forse da stabilire quale fosse la concentrazione di ossigeno nell’atmosfera terrestre prima dell’evoluzione della fotosintesi ossigenica
  • la presenza di fossili, la cui interpretazione non ha ancora messo d’accordo il mondo scientifico, potrebbe contribuire a supportare l’ipotesi che la fotosintesi, in una forma molto semplice, sia emersa per prima
  • studi di filogenesi molecolare supportano al momento l’ipotesi che la respirazione sia comparsa prima della fotosintesi, o almeno prima della fotosintesi ossigenica

fonte principale di quanto riportato: “The Purple Phototrophic Bacteria” By C. Neil Hunter, Fevzi Daldal, Marion C. Thurnauer

spero che ci siano tanti fra quelli che leggono che vorranno contribuire a correggere quanto ho scritto qualora ravvisassero errori e soprattutto che vorranno contribuire a ravvivare questo dibattito ancora aperto 🙂

considerazioni conclusive

Carissimi ragazzi, abbiamo letto e valutato i vostri elaborati e siamo orgogliose di dirvi che complessivamente avete fatto un buon lavoro, siamo molto soddisfatte!

preciso alcune informazioni per chiarire dei misconcetti che ho letto nei vostri elaborati:

  1. sono state inoculate colture liquide fresche a partire da uno striscio fresco su piastra sia il 18 che il 19 dicembre. il 19 dicembre mattina ed il 20 dicembre mattina i preinoculi sono stati diluiti in terreno liquido e fatti crescere per 6 ore monitorando la densità ottica (un esperimento del tutto analogo a quello riportato in questo post). ne consegue che le condizioni delle colture e dei mitocondri utilizzati durante le esercitazioni dai due gruppi erano del tutto analoghe (non c’erano colture fresche un giorno e colture congelate o vecchie l’altro giorno come ho letto)
  2. le aliquote di mix di reazione e di mix di reazione diluita, così come le aliquote di ATP a diverse concentrazioni, sono stati preparati e congelati lo stesso giorno (il 16 dicembre) per tutti e due i gruppi e scongelate solo al momento dell’uso. se ipotizzate quindi fenomeni di degradazione o di perdita di attività devono essere avvenuti a -20°C e non possono essere dovuti al ripetersi di scongelamenti e congelamenti che non sono mai avvenuti

questo era solo per correttezza nel caso in cui alcune delle informazioni di cui disponevate vi fossero risultate poco chiare.

veniamo invece al dunque:

 il 9 gennaio 2012 alle ore 14 e 30 in aula A del piano rialzato

  • alcuni di voi saranno chiamati a presentarci le loro considerazioni conclusive sugli esperimenti riguardanti la fotosintesi
  • Chiara farà una breve presentazione sulla morfologia della foglia
  • Tea farà chiarezza su alcuni punti rimasti aperti: ossigeno e anidride carbonica entrano ed escono dalla foglia? in che misura? con quali meccanismi? perché l’ossigeno prodotto sembra portare al galleggiamento mentre l’anidride carbonica prodotta no?

 il 10 gennaio 2012 alle 11:30 sempre in aula A del piano rialzato

  • riassumiamo le procedure utilizzate per analizzare i dati prodotti in laboratorio col vostro aiuto
  • traiamo le conclusioni sui nostri risultati

vi ricordo che la frequenza a queste lezioni è obligatoria

consegna dell’ultimo elaborato:

entro e non oltre le 20 del giorno 8 gennaio 2012 ciascuno di voi dovrà inviare al seguente indirizzo (elisa.corteggiani@unipd.it) una presentazione costituita da un massimo di 5 diapositive nelle quali dovrà affrontare i seguenti punti:

  1. confronto dei risultati ottenuti replicando lo stesso esperimento (ogni tipo di luce è stato usato da due gruppi in ciascun turno, per un totale di 4 repliche dello stesso esperimento)
  2. confronto dei risultati ottenuti utilizzando le tre diverse luci
  3. effetto della luce verde: aspettative e risultati registrati
  4. il contributo della respirazione: come incide sui nostri risultati sperimentali e che esperimenti disegneresti per valutare questo contributo

le diapositive dovranno contenere un grafico, o un disegno, o una tabella corredati da titolo e didascalia, che spieghi le analisi che avete fatto per rispondere alle domande o che schematizzi la spiegazione che proponete o l’esperimento che progettereste di fare. Non riempite le diapositive di testo perchè non vi si chiede di scrivere una relazione. 

Alcuni di voi saranno chiamati ad esporre le loro presentazioni il 9 gennaio

a questo link trovate tutti i dati di tutti i gruppi da scaricare ed utilizzare per rispondere alle domande che vi sono state poste.

buon lavoro a tutti ed a presto!

alcune osservazioni..

avete tutti chiaro qual è il contenuto della “mix di reazione” ? (questo è il protocollo di riferimento) per quelli che avessero le idee un po confuse eccovi la “ricetta” completa:

  • luciferina
  • luciferasi
  • MgSO4
  • DTT
  • EDTA
  • BSA
  • Tricina

.. divertitevi a cercare in internet le cose che non conoscete, e chiedeteci pure quello che non vi è ancora chiaro 🙂

NOTA BENE: come vedete dentro la mix di reazione non c’è ATP! Infatti la usiamo proprio per quantificare l’ATP nel nostro campione!

RISULTATI 19 e 20 dicembre 2011

Produzione di ATP in mitocondri isolati di lievito

I vostri risultati sperimentali

qui di seguito i risultati sperimentali ottenuti applicando questo protocollo

tabella dei risultati del 19 Dicembre

Griglia dei Risultati 19 Dicembre 2011

Griglia dei risultati del 19 Dicembre: le caselle marcate col bollino verde sono state misurate mentre quelle col bollino grigio non sono state misurate. In alto nella casella è indicato il campione caricato, mentre in basso il valore misurato.

tabella dei risultati del 20 Dicembre

tabella risultati 20 dicembre

Griglia dei risultati del 20 Dicembre: le caselle marcate col bollino verde sono state misurate mentre quelle col bollino grigio non sono state misurate. In alto nella casella è indicato il campione caricato, mentre in basso il valore misurato.

per scaricare i file in formato excel corrispondenti a queste due immagini, cliccate sul link che segue: risultati sperimentali 

nelle prime due file (indicate come fila A e fila B) ci sono le rette di taratura caricate dagli esercitatori. Nella fila A le quantità di ATP caricate sono state indicate nelle singole caselle e la mix di reazione utilizzata è “mix di reazione”; nella fila B le quantità di ATP caricate sono state indicate nelle singole caselle e la mix di reazione utilizzata è “mix di reazione diluita”.

come potete osservare anche le caselle vuote fra un pozzetto caricato e l’altro sono state misurate.. osservate nulla di interessante?

indicazioni precise su come gestire ed elaborare questi dati li trovate in questo post

buon lavoro per il momento!

note per tutti:

se avete difficoltà o domande o osservazioni chiedete tutto quello che volete senza timidezza, ma fatelo attraverso il sito. non è possibile venire in laboratorio a cercarci per i chiarimenti perchè siete tanti e in laboratorio non ci siamo solo noi che lavoriamo

ELABORAZIONE DATI Esercitazione 2: mitocondri all’opera

Produzione di ATP in mitocondri isolati di lievito

Come recuperare, rappresentare ed analizzare i dati

Recupero DEI DATI

I risultati dei vostri esperimenti saranno disponibili su questo sito sotto forma di una tabella con le stesse coordinate della piastra su cui avete caricato i vostri campioni. Le caselle della tabella conterranno il numero di fotoni emessi nell’unità di tempo da ciascuno dei pozzetti della piastra. Facendo riferimento alla tabella riportata in “protocolli” dove sono indicate le posizioni di tutti i campioni ed ai vostri appunti, recuperate i dati relativi all’esperimento del vostro gruppo. Sempre nella tabella dei risuktati troverete le quantità di ATP caricate dagli esercitatori in ciascun pozzetto utilizzato per la retta di taratura.

RAPPRESENTAZIONE ed analisi DEI DATI

Retta di taratura

Realizzate delle tabelle nelle quali riporterete in colonna 1 le coordinate di posizione del pozzetto che state considerando; in colonna 2 la quantità di ATP caricata dagli esercitatori su quel pozzetto (utilizzato per la retta di taratura); in colonna 3 i valori di emissione misurati dal luminometro per quel pozzetto. Le rette di taratura realizzate sono due: una per la mix di reazione; una per la mix di reazione diluita. Dovrete produrre una tabella per ciascuna delle due rette di taratura.

tabella dati retta di taratura

questa tabella è un esempio di come dovrete rappresentare i dati. attenzione i dati all'interno delle caselle sono solo un esempio. per trovare i dati relativi alla retta di taratura per favore utilizzate la tabella riportata in risultati

Una volta ottenuta ciascuna tabella, rappresentate i dati relativi a quantità di ATP e fotoni emessi con un grafico. Ricavate dal grafico la retta che meglio descrive i vostri dati (in gergo il best fit), e trovate la pendenza e l’interpolazione di questa retta.

retta di taratura

L’equazione della vostra retta sarà del tipo: y= A +Bx, dove B è la pendenza e A l’intercetta.

Quantificazione dell’ATP

I due parametri ottenuti A e B vi serviranno per trovare la quantità di ATP presente nei vostri campioni “ATP x mix” e “ATP x mix diluita” e la quantità di ATP prodotta dai vostri mitocondri quando avete misurato utilizzando la mix e quando avete misurato utilizzando la mix diluita.

Sull’elaborato che consegnerete devono esserci chiaramente leggibili: le due tabelle; i due grafici; le due equazioni che avete ricavato; i valori di pendenza e di intercetta di ciascuna delle due rette di taratura; le concentrazioni che avete calcolato per ciascuno dei due campioni che vi sono stati forniti e per i mitocondri da voi preparati. Potete produrre l’elaborato utilizzando un qualsiasi foglio di calcolo di vostra scelta. Al momento di inviarlo alla seguente mail trasformatelo in un documento o foglio di lavoro o presentazione office o open office o altrimenti in un pdf, per esser certi che venga letto correttamente: elisa.corteggiani@unipd.it

I dati di tutti saranno disponibili sul sito per confrontare i risultati dei vari gruppi.

RIELABORAZIONE DEI DATI

I punti della retta di taratura preparati dagli esercitatori lo stesso giorno e congelati verranno misurati due volte dal turno 1 e dal turno 2. Inoltre alcuni dei campioni che vi sono stati forniti denominati “ATP x mix” e “ATP x mix diluita” contengono la stessa quantità di ATP di alcuni punti della retta di taratura. In altre parole abbiamo misurato più volte lo stesso campione in diversi casi. Nell’elaborato che consegnerete provate a rispondere alle seguenti domande:

  1. qual’è l’errore sulla misura e la deviazione standard? come lo avete calcolato?
  2. ci sono differenze rilevabili fra le misure effettuate il primo giorno e il giorno successivo (ad esempio un calo sistematico o un aumento sistematico dei valori)? se si sapreste ipotizzare il perché?
  3. Tutte le vostre misure cadono nell’intervallo di linearità fra quantità di ATP ed emissione?
  4. i vostri mitocondri producono una quantità di ATP comparabile a quelli degli altri gruppi o no? sapreste ipotizzarne il perché?

PROTOCOLLO Esercitazione 2: mitocondri all’opera

Produzione di ATP in mitocondri isolati di lievito

PROTOCOLLO DELL’ESERCITAZIONE

Prima parte: purificazione dei mitocondri

Trasferire tutto  il campione di lieviti che vi verrà consegnato in un tubo da centrifuga e centrifugare per 5 minuti a 3000g

Eliminare tutto il surnatante per svuotamento (gli scarti liquidi vanno messi nel bicchiere di plastica)

Aggiungere al pellet 40 ml di acqua milliQ e risospendere delicatamente

Centrifugare per 5 minuti a 3000g ed eliminare di nuovo il surnatante per svuotamento

Aggiungere al pellet cellulare 2ml di tampone di lavaggio, risospendere delicatamente e trasferire nei tubini da 2ml

Incubare per 15 minuti a 30°C in leggera agitazione. C’è un mixer termostatato sul bancone degli esercitatori.

Centrifugare le cellule per 5 minuti a 1500g nelle centrifughe per tubini e successivamente eliminare il surnatante

Risospendere le cellule in 1 ml di Tampone di risospenzione 1

A questo punto è necessario misurare l’assorbimento del nostro campione. Azzerare lo strumento a 600nm con il bianco adeguato. Preparare il campione da misurare aggiungendo 10μl di cellule a 990 μl di acqua mQ. (La pratica corretta è fare il bianco e diluire con lo stesso tampone in cui è risospeso il vostro campione. Nel vostro caso il tampone non ha un assorbimento rilevabile a 600nm, per cui vi suggeriamo di usare acqua per semplicità)

Calcolate l’assorbimento totale della sospensione cellulare valutando la diluizione che avete effettuato (essempio: OD600nm=0.02; 0.02×100 (diluizione applicata)=2; 2 OD/ml x 2 ml =4 OD).

Aggiungere 0.12μl di Liticasi, mescolare per inversione e porre le cellule a 30°C in leggera agitazione nel solito termomixer sul bancone degli esercitatori. La liticasi è un enzima che digerisce la parete polisaccaridica del lievito.

Gli esercitatori vi comunicheranno al momento dopo quanti minuti fermare la reazione (circa 5-15 minuti)

Fermare la reazione mettendo il tubino in ghiaccio per 5 minuti.

Mentre il campione contenente “sferoplasti” (ovvero cellule deprivate della parete, ma con membrana plasmatica ancora integra) è in ghiaccio, prelevare 10μl del campione e aggiungere 990 μl di Tampone di risospenzione 1. Misurare la densità ottica a 600nm.

Per ottenere i mitocondri dovrete rompere in qualche modo la membrana plasmatica. Lo farete utilizzando un detergente, che serve a scioglierla. Poiché l’attività del detergente può sciogliere anche le membrane del mitocondrio (in particolare quella esterna) è necessario usare una quantità di detergente sufficiente a rompere la membrana plasmatica ma non troppo elevata per evitare danni alle membrane del mitocondrio.

Risospendere gli sferoplasti in 650 μl di Tampone di Lisi contenente il detergente. Porre il tubino in ghiaccio per 5 minuti durante i quali, ogni minuto, mescolerete gli sferoplasti mediante una singola inversione del tubino.

Trascorsi i 5 minuti aggiungete 1300μl di Tampone di Risospensione 2 e mescolate per inversione.

Centrifugare a 600g per 10 minuti

ATTENZIONE! Non eliminate il surnatante ma trasferitelo con attenzione in un nuovo tubino. (il surnatante è costituito dalla gran parte del contenuto della cellula, inclusi i mitocondri, mentre nel pellet ci saranno cellule intere, residui di parete e alcuni nuclei)

Centrifugate il surnatante a 6500g per 10 minuti.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet (contenente i mitocondri purificati) in 250 μl di Tampone di Risospensione 3. Da questo momento in avanti tenete sempre il tubino contenente i mitocondri in ghiaccio (occhio che il ghiaccio si scioglie, ogni tanto va controllato e aggiunto)

A questo punto avrete ottenuto i vostri mitocondri abbastanza puri e speriamo attivi !

Seconda parte: Test di attivita’

Gli esercitatori passeranno da ciascun gruppo con una piastra da 96 pozzetti nera. Dovrete trasferire 50µl delle soluzioni che seguono nei pozzetti della piastra che vi sono stati assegnati:

  • acqua mQ
  • ATP per mix (tappino giallo)
  • ATP per mix diluita (tappino giallo)
  • mitocondri

La mappa di caricamento della piastra è riportata di seguito:

griglia di caricamento

ATTENZIONE: E’ assolutamente importante che carichiate le cose giuste nel posto giusto, perché questa piastra finirà dentro al luminometro a scansione, che ci restituirà una griglia come questa con i valori misurati. Pertanto, se non sapete cosa e dove avete caricato, poi non saprete dove cercare i risultati e come interpretarli. Inoltre le posizioni che vi sono state assegnate sono state disegnate per ottimizzare il risultato del lettore (evitare che campioni vicini possano inquinarsi il segnale fra di loro) per cui non va assolutamente bene se per sbaglio mettete il campione nel pozzetto accanto, perché rovinate il vostro esperimento e quello del vostro vicino

Quando tutti avranno riempito i pozzetti della piastra nera un esercitatore provvederà ad aggiungere contemporaneamente la mix di reazione a tutti i campioni con una micropipetta multicanale e ad effettuare la lettura con il luminometro. Vi verrà restituita in cinque minuti la griglia con i valori misurati.

Vi è stata fornita una soluzione contenente luciferina e luciferasi nel loro tampone ottimale di reazione. Il tubino è etichettato come mix di reazione (etichetta gialla). ATTENZIONE: il contenuto del tubino è sensibile alla luce, pertanto evitate di esporlo alla luce più del necessario per effettuare le operazioni che seguono:

  1. preparate 200µl di mix di reazione diluita 1:25 utilizzando la mix di reazione e il tampone di diluizione. Avvolgete il tubino contenente la soluzione appena preparata in carta alluminio per proteggerlo dalla luce
  2. disponete nella piastra trasparente da 96 pozzetti in dotazione 50µl dei seguenti reagenti nell’ordine indicato:
    • acqua mQ
    • ATP per mix (tappino giallo)
    • ATP per mix diluita (tappino giallo)
    • Mitocondri
griglia di caricamento
  1. Aliquotate nei pozetti in colonna 1; 3; 5   50 µl di mix d reazione diluita.
  2. Aliquotate nei pozetti in colonna 7; 8; 11    50 µl di mix di reazione.
  3. Osservate cosa succede…

MISURIAMO LA PRODUZIONE DI ATP: Esercitazione 2: mitocondri all’opera

Produzione di ATP a partire da zuccheri semplici: il lavoro dei mitocondri

Giusto per rinfrescarvi un po’ la memoria su quello che avete già discusso e studiato durante il corso di Biochimica:

La matrice mitocondriale è il compartimento racchiuso all’interno della membrana interna dei mitocondri. ( Guardate l’immagine qui sotto per avere una mappa della struttura dei mitocondri )

mitocndrio

in questa immagine, presa dal web, è rappresentata la struttura dei mitocondri come è stata dedotta in anni di sperimentazione. una membrana esterna racchiude l'organello. la membrana esterna ha una composizione simile a quella della membrana plasmatica ed è parzialmente permeabile a piccole molecole, mentre un sistema di traslocazione molto selettivo assicura il passaggio delle proteine che servono a far funzionare l'organello e che vengono prodotte nel reticolo endoplasmatico. la membrana interna, molto più selettiva è altamente ripiegata su se stessa e ospita i complessi di proteine di membrana che chiamiamo catena respiratoria. La catena respiratoria consente l'immagazinamento dell'energia in ATP. Lo spazio racchiuso dalla membrana interna si chiama matrice e contiene molti enzimi attivi nel catabolismo della cellula

Si trovano nella matrice :

  • il complesso della pituvato deidrogenasi e tutti gli enzimi del ciclo dell’acido citrico;
  • gli enzimi che catalizzano l’ossidazione degli acidi grassi;
  • i vari enzimi responsabili per l’ossidazione dei diversi amminoacidi

in altre parole tutte le vie di degradazione ossidativa delle molecole energetiche ad esclusione della glicolisi, che avviene nel citosol.

Quindi tutte le molecole energetiche vengono infine indirizzate nella matrice mitocondriale per completarne l’ossidazione. Nella matrice la loro energia viene temporaneamente trasferita a molecole accettrici universali che vengono così ridotte, ad esempio il NADH, il FADH2.

LA catena respiratoria

I complessi proteici della catena respiratoria sono in grado di accettare gli elettroni da queste molecole ridotte e trasferirli via via verso molecole a più bassa energia conservando l’energia residua sotto forma di un gradiente di protoni. I complessi proteici sono infatti inseriti nella membrana interna direzionati e per ogni trasferimento di fatto separano l’elettrone e il protone di un atomo di idrogeno e li conservano ai due lati opposti della membrana. Protoni liberi da una parte e molecole ridotte dall’altra. Vi ricorda qualche altra catena in qualche altro organello ?

catena di trasporto elettronico

LA SINTESI DI ATP

I protoni accumulati in un compartimento tendono a spostarsi nell’altro compartimento secondo equilibro elettrochimico. (ovvero le probabilità di andare da A a B sono uguali a quelle di andare da B ad A per ogni protone. Ma avendo più protoni in A allora ci saranno più protoni che si spostano da A a B che da B ad A ) L’unico canale che hanno a disposizione per spostarsi da un lato all’altro è l’ATP sintasi. Passando attraverso questo canale rendono possibile la sintesi di ATP.

ATP sintasi

Il gradiente elettrochimico costituito dai protoni accumulati nello spazio intermembrana dei mitocondri alimenta la sintesi di ATP. Così infine l’energia ottenuta da varie molecole viene tutta conservata sotto forma di ATP grazie al lavoro dei mitocondri e può essere utilizzata dalla cellula nelle più varie funzioni.

Nella nostra esercitazione isoleremo dei mitocondri e testeremo la loro capacità di produrre ATP partendo da vari substrati. In altre parole tutto il lungo elenco di funzioni che abbiamo riassunto in questa pagina deve funzionare perchè noi possiamo vedere questa trasformazione. Rimarrete sorpresi nel vedere quanto tempo impiegheranno i vostri mitocondri ad effettuare tutte queste azioni.. sapete ipotizzare l’ordine di grandezza del tempo necessario?

LIEVITI IN COLTURA Esercitazione 2: mitocondri all’opera

Produzione di ATP a partire da zuccheri semplici: il lavoro dei mitocondri

La crescita dei lieviti

La parte di lavoro che gli esercitatori hanno fatto per voi durante la mattina

La gran parte dell’attività energetica di una cellula ha luogo nei mitocondri. I mitocondri isolati sono dei campioni particolarmente utili per studiare i meccanismi della respirazione cellulare e la produzione di ATP di un certo campione in studio.

Nel nostro esperimento vogliamo studiare la produzione di ATP in mitocondri isolati dal lievito Saccharomices cerevisiae. Vogliamo crescere i lieviti, raccoglierli, rompere la loro parete, solubilizzare la loro membrana plasmatica e quindi separare i diversi organelli presenti nel citosol sfruttando la diversa densità che hanno.

Per portare avanti questa procedura dobbiamo tenere conto di alcune osservazioni importanti che sono già state fatte da altri scienziati:

  1. I lieviti stressati sviluppano una parete molto più spessa e più ricca in polisaccaridi. Sarà pertanto molto più difficile degradare la parete di questi lieviti al fine di isolarne i mitocondri. I lieviti in fase stazionaria di crescita sono “stressati”, mentre quelli in fase esponenziale non lo sono ed hanno una parete più sottile. Nel nostro esperimento abbiamo deciso di utilizzare lieviti in fase di crescita esponenziale. Per essere certi che la nostra coltura ad una certa densità ottica sia in fase esponenziale, abbiamo dovuto realizzare delle curve di crescita per il nostro ceppo. Qui di seguito è riportata la curva che abbiamo ottenuto crescendo per 6 ore Saccharomices cerevisiae w303-1B in YPD standard (1% estratto di lievito, 2% peptone,2% glucosio) e in YPD con aggiunta di etanolo al 2.5%: curve lievitiin base a questa curva sappiamo che un inoculo di partenza a densità ottica circa uguale a 0.25, se dopo 5 ore si trova a densità ottica pari a circa 0.7 è in fase esponenziale;
  2. Le condizioni in cui la coltura è stata cresciuta influenzano il numero, la morfologia e anche l’attività dei mitocondri che verranno isolati. In particolare la tabella che segue riassume le informazioni che sono state raccolte in anni di esperimenti su mitocondri isolati da lieviti in coltura:
tabella mitocondri lievito

la tabella riportata è tratta dalla scheda tecnica del kit Sigma-Aldrich MITOISO3, potete cliccare sopra per ingrandire la tabella

i vostri esercitatori hanno testato per voi le osservazioni riportate sopra realizzando le curve di crescita di colture in diverse condizioni e testando l’efficienza dei mitocondri isolati a partire da ciascuna di queste colture. La mattina delle esercitazioni delle colture fresche verranno messe a crescere per voi, in modo tale che all’inizio del pomeriggio voi abbiate a disposizione una quantità sufficiente di lieviti con parete sottile e mitocondri attivi.